粗蛋白的測定

參考標準：JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程

GB-T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法

實驗原理：凱氏定氮法是使樣品經硫酸和催化劑一同加熱消化，使有機氮分解轉化為氨與硫酸化合為硫酸氫銨。然后加堿蒸餾，使銨游離出來，用硼酸吸收，再用標準鹽酸滴定，計算氮的含量，乘以6.25可折算成粗蛋白含量。

主要儀器及試劑：

1.凱氏定氮瓶及蒸餾裝置  

2.五水硫酸銅  

3.硫酸鉀     

4.98%濃硫酸

5.2%硼酸溶液:2g硼酸溶于100ml水溶液

6.40%氫氧化鈉溶液:40g氫氧化鈉溶于100ml水溶液

7.0.1%甲基紅：0.1g甲基紅溶于100ml乙醇溶液，攪拌溶解                     

8.0.5%溴甲酚綠：0.5g溴甲酚綠溶于100ml乙醇溶液，攪拌溶解

9.甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑：0.1%甲基紅與0.5%溴甲酚綠等體積混合，保存期三個月。

10.0.02mol/L的鹽酸標準溶液(保存期2個月)

實驗操作步驟：

1.稱樣：

按粗蛋白含量稱取樣品質量（可控制點：降低容量誤差對結果絕對誤差的影響），

準確至0.0002g，置于干燥的消化管中（可控制點：避免樣品粘掛于消化管壁影響樣品的消化）。

2.消化：加入硫酸銅約0.4g，加入硫酸鉀約6g，輕輕抖動搖勻，再加入15ml濃硫酸，搖勻，開始應小火加熱使樣品焦化、泡沫消失(可控制點：避免樣品在消化過程中上沖粘附于消化管壁)，在消化爐上消化一定的時間至消化液呈澄清透明的藍綠色，相應的消化時間對應于上表中，最終的消化仲裁判定應在溶液澄清后繼續(xù)消化至少30min（可控制點：消化完全）。

3.轉移：將試樣消煮液冷卻，用洗瓶加入少量蒸餾水稀釋（不可直接轉移高濃度的消煮液，因為稀釋是個劇烈的放熱過程，容易炸裂容量瓶），搖勻，轉入100ml容量瓶中，轉移過程應充分，A.確保轉移過程中消化管口始終在漏斗之上并向下傾斜，用帶細尖嘴洗瓶沖洗管口3遍，在漏斗上靠掉管口邊緣溶液再向上豎起，B.沖洗內壁，上下甩動3次，同A轉移入容量瓶中，再重復2次。

4.定容:冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。嚴禁熱定容，即溶液未冷卻進行定容。要加速冷卻過程，可將容量瓶蓋好蓋子放入流水中進行冷卻。

5.蒸餾：

A.蒸汽發(fā)生器的水中應加入甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補加硫酸（可控制點：確保水中氨以硫酸銨形式存在，保證蒸餾過程中空白的穩(wěn)定性）。

B.將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20ml硼酸吸收液和2滴溴甲酚綠—甲基紅指示劑的錐形瓶內。

C.用待蒸餾試樣分解液潤洗移液管2cm長末端，再放入容量瓶中吸取試液潤洗移液管2-3次；準確移取試樣分解液10.00ml注入蒸餾裝置的反應室中，放入時移液管應靠在反應室入口的底部上，放完后不可用蒸餾水沖洗移液管外壁；用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml左右氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，直至反應液變棕色，將玻璃塞塞好，且有堿剩余在入口處密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面，用蒸餾水沖洗冷凝感末端，洗液均流入錐形瓶內，再蒸餾1min（可控制點：以pH試紙指示蒸餾終點），然后停止蒸餾。

6.滴定：用0.02mol/L標準鹽酸溶液滴定，溶液由綠色或藍綠色變?yōu)榈t色為終點。同樣條件做空白，取10.00ml水從步驟2開始或者從步驟5開始。

7.計算：

粗蛋白（%）= EQ EQ EQ \A() \F(（V₁-V₀）×C×0.0140×6.25,m×10.00/100.0) ×100%

注意事項：

1.消化時若不易呈透明溶液，可將試液放冷后慢慢加入30％過氧化氫2—3mL，以促進氧化。如試樣是含脂類特別多的樣品，有時需要增加濃硫酸的用量，如分解冷卻后，消化液呈完全固體狀態(tài)，則是濃硫酸量不足，氮的回收率會降低。

2.消化過程中保持緩慢沸騰，避免試樣濺于瓶壁，難于消化使氨損失。

3.實驗中要保證硫酸足量，因為過多的硫酸鉀形成硫酸氫鉀，會削弱了硫酸的消化作用，硫酸鉀的作用是增加溶液的沸點，硫酸鉀添加量過少加速消化作用將減弱，加入過多溶液會析出結晶，共結晶現象將使部分硫酸氫銨損失。

4.消化時間視不同樣品含脂肪，蛋白質的量而定，消化液按黑色→黃綠色→綠色→藍色或淺綠色變化，一般樣品消化液呈現綠色后，再消化30min即可（樣品消化液通常開始為黑色，不久變成藍色澄清狀態(tài)，這種過程是炭化的有機物完全被氧化的變化，而它決不表示樣品中的氮素全部轉化為NH⁴⁺的變化，一般情況樣液澄清后繼續(xù)消化60min，其氮素的回收率最理想。

5.通入蒸汽蒸餾時，吸收瓶中的硼酸接收液溫度不宜超過40℃，如果超過45℃硼酸對NH₃的吸收減弱，造成氮的損失。可以采取的措施包括降低蒸汽通入量(比如分流蒸汽或者降低加熱溫度)、增加冷卻水流量、使用其他可能的措施降低吸收液溫度。

6.NH⁴⁺是以NH₃的形式完全蒸餾出來的，可用pH試紙或紅色石蕊試紙檢驗餾出液是否呈堿性以判定蒸餾終點。

7.標準酸濃度的準確濃度（程度）對測定結果影響很大，因此，標準酸的濃度必須準確認真標定。

8. 硫酸銨回收率測定

精確稱取0.25g～0.30g硫酸銨，代替試樣按標準中試樣消解方法進行消解，測得的硫酸銨中氮的含量應是21.19±0.2%,否則應檢查儀器的氣密性、標準溶液是否正確。

氮含量（%）= EQ EQ

式中：

V₁   ——滴定試樣所需標準溶液的體積， V₀  ——滴定空白所需標準溶液的體積，

C  ——標準溶液的濃度，             M  ——試樣的質量，

100——試樣分解液定容體積，         10 ——用于蒸餾的分解液的體積。

硫酸銨有吸濕性，固結成塊，在105℃烘干1個小時能保證硫酸銨的干燥同時把硫酸銨分解質量損失降低在可接受的誤差范圍內<0.2%。