粗蛋白的測定
參考標(biāo)準(zhǔn)：JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程
GB-T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法
實驗原理：凱氏定氮法是使樣品經(jīng)硫酸和催化劑一同加熱消化，使有機氮分解轉(zhuǎn)化為氨與硫酸化合為硫酸氫銨。然后加堿蒸餾，使銨游離出來，用硼酸吸收，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，計算氮的含量，乘以6.25可折算成粗蛋白含量。
主要儀器及試劑：
1.凱氏定氮瓶及蒸餾裝置
2.五水硫酸銅
3.硫酸鉀
4.98%濃硫酸
5.2%硼酸溶液:2g硼酸溶于100ml水溶液
6.40%氫氧化鈉溶液:40g氫氧化鈉溶于100ml水溶液
7.0.1%甲基紅：0.1g甲基紅溶于100ml乙醇溶液，攪拌溶解
8.0.5%溴甲酚綠：0.5g溴甲酚綠溶于100ml乙醇溶液，攪拌溶解
9.甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑：0.1%甲基紅與0.5%溴甲酚綠等體積混合，保存期三個月。
10.0.02mol/L的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(保存期2個月)
實驗操作步驟：
1.稱樣：
按粗蛋白含量稱取樣品質(zhì)量（可控制點：降低容量誤差對結(jié)果絕對誤差的影響），
準(zhǔn)確至0.0002g，置于干燥的消化管中（可控制點：避免樣品粘掛于消化管壁影響樣品的消化）。
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稱樣量 /g |
消化時間/min |
滴定體積/ml |
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25ml(±0.04) |
50ml(±0.05) |
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10 |
0.87 |
70 |
>10 |
0.16 |
0.20 |
|
20 |
0.88 |
70 |
>10 |
0.16 |
0.20 |
|
30 |
0.58 |
70 |
>10 |
0.24 |
0.30 |
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40 |
0.66 |
70 |
>15 |
0.21 |
0.27 |
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50 |
0.53 |
70 |
>15 |
0.27 |
0.33 |
|
60 |
0.58 |
70 |
>20 |
0.24 |
0.30 |
|
70 |
0.50 |
70 |
>20 |
0.28 |
0.35 |
|
80 |
0.44 |
70 |
>20 |
0.32 |
0.40 |
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90 |
0.39 |
70 |
>20 |
0.36 |
0.45 |
2.消化：加入硫酸銅約0.4g，加入硫酸鉀約6g，輕輕抖動搖勻，再加入15ml濃硫酸，搖勻，開始應(yīng)小火加熱使樣品焦化、泡沫消失(可控制點：避免樣品在消化過程中上沖粘附于消化管壁)，在消化爐上消化一定的時間至消化液呈澄清透明的藍綠色，相應(yīng)的消化時間對應(yīng)于上表中，最終的消化仲裁判定應(yīng)在溶液澄清后繼續(xù)消化至少30min（可控制點：消化完全）。
3.轉(zhuǎn)移：將試樣消煮液冷卻，用洗瓶加入少量蒸餾水稀釋（不可直接轉(zhuǎn)移高濃度的消煮液，因為稀釋是個劇烈的放熱過程，容易炸裂容量瓶），搖勻，轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，轉(zhuǎn)移過程應(yīng)充分，A.確保轉(zhuǎn)移過程中消化管口始終在漏斗之上并向下傾斜，用帶細尖嘴洗瓶沖洗管口3遍，在漏斗上靠掉管口邊緣溶液再向上豎起，B.沖洗內(nèi)壁，上下甩動3次，同A轉(zhuǎn)移入容量瓶中，再重復(fù)2次。
4.定容:冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，作為試樣分解液。嚴(yán)禁熱定容，即溶液未冷卻進行定容。要加速冷卻過程，可將容量瓶蓋好蓋子放入流水中進行冷卻。
5.蒸餾：
A.蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，硫酸數(shù)滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補加硫酸（可控制點：確保水中氨以硫酸銨形式存在，保證蒸餾過程中空白的穩(wěn)定性）。
B.將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20ml硼酸吸收液和2滴溴甲酚綠—甲基紅指示劑的錐形瓶內(nèi)。
C.用待蒸餾試樣分解液潤洗移液管2cm長末端，再放入容量瓶中吸取試液潤洗移液管2-3次；準(zhǔn)確移取試樣分解液10.00ml注入蒸餾裝置的反應(yīng)室中，放入時移液管應(yīng)靠在反應(yīng)室入口的底部上，放完后不可用蒸餾水沖洗移液管外壁；用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml左右氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室，直至反應(yīng)液變棕色，將玻璃塞塞好，且有堿剩余在入口處密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面，用蒸餾水沖洗冷凝感末端，洗液均流入錐形瓶內(nèi)，再蒸餾1min（可控制點：以pH試紙指示蒸餾終點），然后停止蒸餾。
6.滴定：用0.02mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定，溶液由綠色或藍綠色變?yōu)榈t色為終點。同樣條件做空白，取10.00ml水從步驟2開始或者從步驟5開始。
7.計算：
粗蛋白（%）= EQ EQ EQ \A() \F(（V1-V0）×C×0.0140×6.25,m×10.00/100.0) ×100%
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式中 C： |
鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度；mol/L |
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0.0140： |
1.00ml鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液〔C（HCl）=1.000mol/L〕相當(dāng)于N的質(zhì)量；g |
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6.25： |
氮換算成蛋白質(zhì)的平均數(shù)； |
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m： |
試樣重量；g |
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V1： |
試樣滴定時耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；ml |
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V0： |
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移取試樣分解液體積；ml |
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100.0： |
試樣分解液定容體積；ml |
注意事項：
1.消化時若不易呈透明溶液，可將試液放冷后慢慢加入30％過氧化氫2—3mL，以促進氧化。如試樣是含脂類特別多的樣品，有時需要增加濃硫酸的用量，如分解冷卻后，消化液呈完全固體狀態(tài)，則是濃硫酸量不足，氮的回收率會降低。
2.消化過程中保持緩慢沸騰，避免試樣濺于瓶壁，難于消化使氨損失。
3.實驗中要保證硫酸足量，因為過多的硫酸鉀形成硫酸氫鉀，會削弱了硫酸的消化作用，硫酸鉀的作用是增加溶液的沸點，硫酸鉀添加量過少加速消化作用將減弱，加入過多溶液會析出結(jié)晶，共結(jié)晶現(xiàn)象將使部分硫酸氫銨損失。
4.消化時間視不同樣品含脂肪，蛋白質(zhì)的量而定，消化液按黑色→黃綠色→綠色→藍色或淺綠色變化，一般樣品消化液呈現(xiàn)綠色后，再消化30min即可（樣品消化液通常開始為黑色，不久變成藍色澄清狀態(tài)，這種過程是炭化的有機物完全被氧化的變化，而它決不表示樣品中的氮素全部轉(zhuǎn)化為NH4+的變化，一般情況樣液澄清后繼續(xù)消化60min，其氮素的回收率最理想。
5.通入蒸汽蒸餾時，吸收瓶中的硼酸接收液溫度不宜超過40℃，如果超過45℃硼酸對NH3的吸收減弱，造成氮的損失。可以采取的措施包括降低蒸汽通入量(比如分流蒸汽或者降低加熱溫度)、增加冷卻水流量、使用其他可能的措施降低吸收液溫度。
6.NH4+是以NH3的形式完全蒸餾出來的，可用pH試紙或紅色石蕊試紙檢驗餾出液是否呈堿性以判定蒸餾終點。
7.標(biāo)準(zhǔn)酸濃度的準(zhǔn)確濃度（程度）對測定結(jié)果影響很大，因此，標(biāo)準(zhǔn)酸的濃度必須準(zhǔn)確認真標(biāo)定。
8. 硫酸銨回收率測定
精確稱取0.25g～0.30g硫酸銨，代替試樣按標(biāo)準(zhǔn)中試樣消解方法進行消解，測得的硫酸銨中氮的含量應(yīng)是21.19±0.2%,否則應(yīng)檢查儀器的氣密性、標(biāo)準(zhǔn)溶液是否正確。
氮含量（%）= EQ EQ
式中：
V1 ——滴定試樣所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積， V0 ——滴定空白所需標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，
C ——標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度， M ——試樣的質(zhì)量，
100——試樣分解液定容體積， 10 ——用于蒸餾的分解液的體積。
硫酸銨有吸濕性，固結(jié)成塊，在105℃烘干1個小時能保證硫酸銨的干燥同時把硫酸銨分解質(zhì)量損失降低在可接受的誤差范圍內(nèi)<0.2%。
